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由于在流式細胞實驗過程中，熒光抗體對單細胞懸液的標記效果直接影響實驗的數(shù)據(jù)質(zhì)量。因此，需要考慮各種影響流式抗體品質(zhì)及檢測效果的因素，例如抗體特異性、熒光素信號強弱、熒光素標記方式、同型對照等。
流式抗體的選擇：
1 流式抗體本身也是抗體，所以選擇流式抗體一定要滿足抗體選擇zui基本的條件：目標蛋白特異性，反應種屬以及應用實驗。
2 流式抗體熒光標記的方式包括直接標記和間接標記兩種。在流式實驗過程中，盡量減少實驗工序和過程，以保證實驗的真實和準確性。因此在條件允許的范圍內(nèi)，建議盡量用直接標記的抗體進行實驗而不去做間接標記。
3 流式抗體熒光標記的選擇：如果實驗中檢測單一指標：不同熒光標記在不同的儀器上強度不同。FACS Calibur儀器為例：PE ＞APC ＞PE-Cy5 ＞PerCP ＞FITC ＞PerCP-Cy5.5，通常來說，PEzui強，適用于弱表達抗原。FITC強度較弱，適用于強表達抗原，使用范圍比較廣。用戶需根據(jù)檢測的目標蛋白進行具體選擇。如果同時檢測多個指標：確認流式細胞儀能檢測多少個通道：流式抗體每個通道只能選擇1種熒光素。各個通道之間的熒光素可以隨意搭配。如：實驗者同時檢測三個指標，可以在圖1中綠色、和紅色三個通道中各選一個適當?shù)臒晒馑貥擞洠現(xiàn)ITC、PE和PE-cy5。切忌所有指標選擇同一個通道的熒光標記，以防止熒光的重疊和相互干擾，影響zui后結果。因此，流式細胞儀的通道越多，同一份樣本能同時做的表面/胞內(nèi)標志就越多。常用熒光標記包括FITC, PE, PEcy5, PEcy5.5, APC等。
同型對照的選擇：
流式細胞實驗和其他抗體相關實驗有點不同的就是需要選擇同型對照。同型對照，是用于消除由于抗體非特異性結合到細胞表面而產(chǎn)生的背景染色，相當于實驗的陰性對照。同型對照選擇與標記抗體同種屬來源，同亞型，同熒光標記的抗體。比如：抗人的CD3的PE標記的抗體，小鼠的IgG2a。同型對照選擇PE標記的小鼠的IgG2a。
流式抗體使用注意事項：
1、建議實驗細胞的數(shù)量和抗體的比例要適當。細胞過量或抗體過量都可能使實驗結果受影響，因此需要優(yōu)化試驗條件。注：不同的流式技術對抗體的需求量有較大差異，例如傳統(tǒng)流式細胞術 （采用鞘液流系統(tǒng)）需要1×106個細胞為起始上樣量，抗體用量為10μl，而微流式細胞術 則只需5×105個細胞，抗體用量減少到5μl。
2、直標的流式抗體應該4℃避光保存，不要冷凍。
3、盡量選擇經(jīng)實驗驗證的流式抗體，以保證實驗結果。